Neben dem Rathaus das imposanteste Bauwerk auf dem historischen Alten Markt in Stralsund, ist die ehemalige Haupt- und Ratskirche St. Nikolai zudem die älteste der drei städtischen Pfarrkirchen.
Im Jahre 1276 erstmals urkundlich bezeugt, wich der zunächst als Hallenkirche konstruierte Sakralbau im Zuge der wachsenden Bedeutung Stralsunds als Seehandelsstadt einer kathedralartigen dreischiffigen Basilika mit zwei Türmen und Kreuzrippengewölbe, nach dem architektonischen Vorbild der Lübecker Marienkirche.
Die gotischen Turmspitzen wurden durch den Stadtbrand von 1662 zerstört. Seither trägt lediglich der 103 Meter hohe Südturm eine barocke Haube, der Nordturm hingegen wurde aus finanziellen Gründen nur mit einem flachen Satteldach gedeckt. Gleichwohl gilt die Stralsunder Nikolaikirche als eindrucksvolles Beispiel norddeutscher Backsteingotik.
Nicht zuletzt ihre Inneneinrichtung kann sich sehen lassen. Zu den erhaltenen Schätzen aus sieben Jahrhunderten gehören die prächtige Kanzel aus dem Jahr 1611, etliche Altäre (u.a. die steinerne Tauffünte von 1260), eine astronomische Uhr von 1394, Überreste des sogenannten Nowgorodfahrergestühls aus dem 14. Jahrhundert, Relieftafeln des Rigafahrergestühls von 1420, die einzigartige Großplastik Anna Selbdritt aus dem 13. Jahrhundert, die spätgotische Greiffenheimsche Kapelle mit farbigen Glasfenstern („Schreiterfenster“) sowie die neogotische Orgel des berühmten Orgelbauers Carl August Bucholz aus dem Jahr 1841.
Auch die mühsam freigelegten Malereien des Orgelchors über dem Hochaltar und des Bläserchors im Mittelschiff von 1505 können heute wieder bewundert werden. Äußerlich besonders bemerkenswert sind die Strebepfeiler an der Außenfassade sowie das kunstvoll gestaltete Hauptportal, welches auf westlicher Seite durch den „Buttergang“ zwischen Kirche und Rathaus zu erreichen ist. Ein weiterer Zugang besteht seit 2003 wieder auf dem Alten Markt. Über den dreistimmig eingeläuteten evangelischen Gottesdienst hinaus ist St. Nikolai auch kultureller Veranstaltungsort von Konzerten und Ausstellungen.